La Provincia de Chiquimula de la Sierra fue sometida en 1525 por los capitanes Juan Pérez Dardón, Sancho de Barahona y Bartolomé Becerra, capitanes españoles que actuaban a las órdenes de Pedro de Alvarado. Ellos y Conciso Hernández, llevaron la religión católica a toda la región y por esos años fue conquistada Esquipulas por primera vez.
Se cree que, en el año 1525, los habitantes de lugar, junto con los de Mitlán, no pudiendo soportar la pérdida de su libertad y siguiendo el ejemplo de otros pueblos que se alzaron en armas, se sublevaron encabezados por los caciques Copantl-Galel, declarándose independientes de los españoles en el mes de abril del año 1530.
A raíz de ese levantamiento, el juez visitador Don Francisco de Orduña ordenó que en los últimos días de marzo los capitanes Pedro de Amalín y Hernando de Chávez, de sus alejamientos en Mitlán, marcharan a Esquipulas para pacificar a los sublevados.
Iban acompañados por una columna compuesta por 60 infantes, 400 indios auxiliares y 30 caballos. Luego de haber perdido el camino y buscando senderos menos controlados por los indígenas del lugar llegaron por fin al pueblo de Esquipulas, el cual estaba muy bien atrincherado, razón por la cual no lograban ingresar fácilmente.
Luego de una tregua de tres días, los pobladores decidieron hacer un pacto de paz al cuarto día, más por buscar la paz de la localidad que por temor a los conquistadores.
Después de verificados los puntos acordados, los españoles procedieron a instalarse por varios días en el lugar mientras reconstruían los destrozos ocasionados en pueblos vecinos.
Mientras duraba esta etapa de colonización, los misioneros que acompañaban a los españoles prosiguieron su trabajo de evangelización y catequesis. Poco a poco fue introduciéndose el cristianismo en dichos lugares, acostumbrados como estaban a tener de por sí una vida bastante religiosa según sus creencias.
Entre los años 1560 y 1570 fue fundada la Villa de Esquipulas por los españoles, quienes comenzaron a convivir con los chortíes, habitantes del lugar.